cơ sở phân loại GRAM ÂM - GRAM DƯƠNG [Lưu Trữ]

bebadboy87

24-11-2008, 07:43 AM

1/ Phương pháp nhuộm Gram còn gọi là phương pháp nhuộm phân biệt :
Vì giúp ta phân biệt vi khuẩn thành 2 nhóm lớn: vi khuẩn G+ (gram-positive) bắt màu tím và vi khuẩn G- (gram-negative) bắt màu hồng. Ngoài ra nó còn giúp ta quan sát rõ và phân biệt về hình dáng, cấu tạo, cách phân bố của các loại vi khuẩn khác nhau.

2/ Mô tả sự khác nhau giữa vách tế bào G+ và G- :
Vách tế bào G+ : rất dày gồm một lớp peptidoglycan còn được gọi là murein chiếm 80%-90% thành phần vách tế bào.

Peptidoglycan là loại polime xốp, không tan, khá cứng và bền vững bao quanh tế bào như một mạng lưới. Cấu trúc cơ bản của peptidoglycan gồm 3 thành phần: N-acetylglucosamine (NAG), acid N-acetylmuramic (NAM) và tetrapeptide gồm cả loại L và D acid amine.

Ðể tạo thành mạng lưới cứng, tetrapeptide trên mỗi chuỗi peptidoglycan liên kết chéo với tetrapeptide trên chuỗi khác.

Bên trong lớp peptidoglycan là acid teichoic - hợp chất polymer của ribitol-phosphate và glycerol phosphate - một thành phần đặc trưng của tế bào vi khuẩn G+ vừa liên kết với peptydoglycan vừa liên kết với màng sinh chất. Phần liên kết với peptidoglycan gọi là acid lipoteichoic.
Hiện nay đã biết được nhiều kiểu peptidoglycan ở các loài khác nhau gọi là cầu trung gian.

Vách tế bào G-: có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp. Trong cùng là một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide.

Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8-10 nm gồm 3 thành phần:
+ Lipid A.
+ Polysaccharide lõi.
+ Kháng nguyên O.
Màng ngoài còn có thêm các protein:
+ Protein cơ chất: porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ…
+ Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngoài như: nucleotide, vitamin B12,…
+ Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài.

3/ Mô tả và giải thích sự bắt màu của vi khuẩn G+ và G- qua từng giai đoạn nhuộm màu :

Bước 1: nhuộm tím tinh thể (crystal violet) trong 1 phút.
G+ và G- đều có màu tím do màu thấm vào lớp peptidoglycan của G+ và màng ngoài của G-.

Bước 2: thêm dung dịch Lugol, để 1 phút.
G+ và G- có màu tím đậm hơn do iot tạo phức chất màu với tím tinh thể và cố định màu.

Bước 3: Tẩy bằng cồn 96o (15-30 giây).
G+ cồn làm cho các lỗ peptidoglycan co lại do đó phức chất tím tinh thể - iot bị giữ lại trong tế bào.
G- do cồn làm tan lớp màng ngoài có màu, bản chất là lipid dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím tinh thể - iot, do đó trong giai đoạn này G- sẽ mất màu.

Bước 4: nhộm tiếp Safranin hay Fuchsin Ziehl.
G+ vẫn giữ màu tím do không bắt màu Safranin hay Fuchsin Ziehl còn G- bắt màu hồng.
Kết luận: với phương pháp nhuộm Gram như trên, G+ giữ lại màu tím, G- giữ lại màu hồng.

4/ Cách cố định tiêu bản :
Mục đích là giết chết vi khuẩn và giữ vi khuẩn cố định trên kính không bị trôi trong quá trình nhuộm. Các cách cố định tiêu bản:
_ Bằng ngọn lửa: hơ nhanh tiêu bản qua ngọn lửa đèn cồn .
_ Bằng cồn: cho cồn 96o vào tiêu bản và để cồn bay hơi hết.
_ Ðể tiêu bản khô tự nhiên.

5/ Các yếu tố làm sai lệch kết quả nhuộm :
* Sai xót trong thao tác nhuộm Gram, do thực hiện chưa chính xác một vài giai đoạn sau:
+ Cố định tiêu bản bằng ngọn lửa không đúng sẽ làm cho màng tế bào bị biến tính dẫn đến sai lệch kết quả nhuộm.
+ Nhuộm tím tinh thể quá lâu ở G- làm màu thấm vào lớp peptidoglycan bên trong, nên khi tẩy bằng cồn không thể làm sạch màu tím dẫn đến việc G- bắt màu như G+.
* Do thời gian nuôi cấy, tuổi của vi khuẩn: nuôi cấy vi khuẩn nhiều lần làm mất dần tính chất điển hình của chúng, vì vậy khi nhuộm sẽ không chính xác.
* Cấu trúc lớp peptidoglycan của nhiều loài vi khuẩn không phải lúc nào cũng giống nhau hoàn toàn, độ dày có thể sai khác vì vậy khi thực hiện phương pháp nhuộm phải chú ý đến thời gian nhuộm hoá chất cho thích hợp với từng loài.

6/ Cấu trúc vách tế bào trực khuẩn lao, vỏ nhầy, bào tử ?* Trực khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) do Robert Koch phát hiện ra vào năm 1882, có thể sắp xếp thành nhiều dạng khác nhau tùy thuộc vào môi trường và thời gian nuôi cấy: dạng que mảnh, dạng hạt chuỗi, phân nhánh…không có giáp mạc, không có tiên mao và không sinh bào tử.
Về bản chất hóa học, trực khuẩn lao thuộc loại vi khuẩn G+ do chứa lớp peptidoglycan, acid teichoic và không có lớp lipidpolysaccharide như vi khuẩn G-. Tuy nhiên ở lớp ngoài cùng thành tế bào chứa nhiều lipid và acid mycolic nên khó nhuộm bằng phương pháp nhuộm Gram, thường nhuộm bằng phương pháp Ziehl-Neelson, trực khuẩn lao bắt màu hồng còn các vi khuẩn khác bắt màu xanh. Các yếu tố của vách tế bào gồm:

+ Lipid: rất giàu, thường liên kết với protein và polysaccharide. Lipid chiếm khoảng 40% trọng lượng khô tế bào, có vai trò quyết định tính chất kháng acid-alcool của vi khuẩn. Các Mycobacterium tuberculosis hoạt tính mạnh có yếu tố tạo thừng liên quan đến tính độc của vi khuẩn vì nó có tác dụng ngăn cản sự di chuyển của bạch cầu.

+ Protein: gây mẫn cảm và kích thích tạo kháng thể khi nhiễm vào cơ thể.

+ Polysaccharide: bản chất như một kháng nguyên trong các phản ứng với huyết thanh.

+ Acid mycolic: được cấu tạo gồm 60 đến 90 nguyên tử C và đóng vai trò liên kết các phân tử hydrophobic với lipid.
* Vỏ nhầy (capsule): Ở một số loài vi khuẩn bên ngoài thành tế bào còn có một lớp bao nhầy hay còn gọi là giáp mạc. Đó là một lớp vật chất dạng keo, có thể rất mỏng hoặc rất dày và tùy theo kích thước của vỏ nhầy người ta chia thành:
+ Vỏ nhầy mỏng (microcapsule).
+ Vỏ nhầy (capsule).
+ Khối nhầy (zooglea).
Có khi vỏ nhầy bao bọc cả một nhóm vi khuẩn. Chỉ có một số loài vi khuẩn có khả năng tạo vỏ nhầy và sự hình thành vỏ nhầy cũng tùy thuộc nhiều vào môi trường, ví dụ đối với các vi khuẩn gây bệnh thì vỏ nhầy chỉ được tạo ra khi chúng hiện diện trong cơ thể vật chủ còn khi ra khỏi cơ thể và được nuôi trong các môi trường dinh dưỡng nhân tạo, vi khuẩn mất khả năng sinh vỏ nhầy nhưng vẫn sống, sinh trưởng, phát triển và sinh sản bình thường.

Thành phần chủ yếu của vỏ nhầy là polysaccharide, ngoài ra còn có polypeptide và protein. Vỏ nhầy polysaccharide chiếm tỉ lệ lớn (Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Xanthomonas, Corynebacterium…). Vỏ nhầy của một số loài Bacillus như Bacillus anthracis, Bacillus subtilis…được cấu tạo bởi polypeptide, chủ yếu là acid polyglutamic.

Vỏ nhầy là một yếu tố rất quan trọng trong việc bảo vệ sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn do:

+ Tăng độc lực làm vi khuẩn có tính gây bệnh cao, làm cho bạch cầu không đến gần được vi khuẩn, tránh được hiện tượng thực bào (phagocytosis).
+ Dự trữ và cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi môi trường sống thiếu thức ăn.
+ Tránh khỏi sự bám dính và xâm nhập của phage.
+ Giúp vi khuẩn bám được vào bề mặt một số giá thể.
+ Tích trữ một số sản phẩm trao đổi chất.
+ Bảo vệ vi khuẩn tránh khỏi thương tổn khi môi trường khô hạn.

* Bào tử (spore): Một số vi khuẩn vào cuối thời kì sinh trưởng phát triển sẽ sinh ra bên trong tế bào một thể nghỉ có sức chống đỡ rất cao ở dạng hình cầu hay bầu dục được gọi là bào tử hay nội bào tử (endospore). Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu.

Chỉ có một số loài vi khuẩn có khả năng sinh bào tử: Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium tetani, Clostridium perfingens, Clostridium botulinum…

Bào tử được hình thành từ trong tế bào vi khuẩn qua nhiều giai đoạn và mỗi tế bào chỉ sinh ra 1 bào tử. Các tế bào có khả năng tạo bào tử gọi là tế bào sinh dưỡng. Trong tế bào này, bào tử dần được hình thành đồng thời tế bào sinh dưỡng tự tiêu hủy dần đến cuối cùng chỉ còn lại nha bào tự do.
Đặc điểm, thành phần cấu tạo nên bào tử gồm:

+ Màng ngoài: là phần còn sót lại của tế bào sinh dưỡng, khi có khi không, khi dày khi xốp và gồm 2 lớp, thành phần chủ yếu là lipoprotein, một lượng nhỏ acid amine, tính thẩm thấu kém.

+ Lớp áo bào tử: nằm dưới màng ngoài, cấu tạo chủ yếu là các protein sừng và một ít phospholipoprotein. Có sức đề kháng rất cao với lysosyme, proteinase, các chất hoạt động bề mặt…

+ Lớp vỏ bào tử: nằm dưới lớp áo, chứa một lượng lớn peptidoglycan, không có acid teichoic. Ngoài ra còn chứa nhiều calcium, acid dipicolinic dưới dạng muối calcium dipicolinate. Acid dipicolinic là chất đặc hiệu của nha bào và chính nhờ calcium dipicolinate (DPA-Ca) quyết định khả năng chịu đựng của nha bào đối với sức nóng. Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ này cao tới 20 atm.

+ Lõi bào tử: dưới lớp vỏ, được cấu tạo bởi 4 thành phần như một tế bào bình thường của vi khuẩn: thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất và vùng nhân. Tuy nhiên, người ta nhận thấy rằng không có sự hiện diện của acid teichoic mà lại có DPA-Ca trong bào tử chất.

7/ Tại sao trực khuẩn lao giữ màu hồng sau khi tẩy cồn-acid ?

Trước khi tẩy cồn: phết kính tiêu bản, cố định mẫu sau đó nhuộm Fuchsin đậm đặc thấm ướt giấy lọc và hơ nóng liên tục từ 5-7 phút. Mục đích của thao tác này nhằm phá vỡ lớp màng ngoài để peptidoglycan bên trong có khả năng bắt màu hồng Fuchsin và sau khi tẩy cồn-acid, hợp chất này sẽ làm các lỗ peptidoglycan co lại do đó trực khuẩn lao giữ lại được màu hồng.

8/ Tại sao không cố định vết bôi bằng hơi nóng khi làm tiêu bản nhuộm vỏ nhầy ?

Vì cấu tạo của vỏ nhầy là polysaccharide, ngoài ra còn có polypeptide, protein. Các hợp chất này rất dễ bị tác động của nhiệt độ làm ảnh hưởng đến tính chất hóa học, vì vậy cấu trúc vỏ nhầy sẽ bị thương tổn khi ta cố định tiêu bản bằng hơi nóng, kết quả sẽ không nhuộm và quan sát được vỏ nhầy.

9/ So sánh phương pháp khử trùng giữa nhiệt ướt và nhiệt khô, phương pháp nào hiệu quả hơn, tại sao ?

Nhiệt ướt

- Sử dụng áp lực hơi bão hòa
- Làm đông tụ protein của tế bào.
- Khử trùng chủ yếu cho các chất, thiết bị không nhạy cảm với nhiệt độ.

Nhiệt khô

- Oxy hóa protein tế bào.
- Không dùng để khử trùng môi trường lỏng, các chất dẻo…
- Tế bào vẫn có khả năng sống sót.
- Nhiệt độ và thời gian khử khuẩn tùy vào thiết bị.
_Trong 2 phương pháp trên, nhiệt khô hiệu quả thấp hơn, đòi hỏi thời gian khử trùng lâu hơn và nhiệt độ cao hơn so với nhiệt ướt. Để giết tế bào vi khuẩn bao gồm bào tử, nhiệt ướt chỉ dùng áp suất hơi bão hòa ở 121-132oC trong vòng 30-40 phút trong khi phương pháp nhiệt khô ta phải nâng nhiệt lên đến 160-170oCvới thời gian từ 2-4 giờ.

10/ Phương pháp nhiệt ướt diệt vi khuẩn bằng cách nào ? Hãy kể ra 2 phương pháp bằng nhiệt ướt trong phòng thí nghiệm ?

- Khử trùng bằng phương pháp nhiệt ướt tiết kiệm được thời gian tiêu diệt vi sinh vật do sự tác dụng của hơi nước dưới áp suất làm tổn thương trực tiếp đến các cấu trúc chủ yếu của tế bào như màng tế bào, làm bất hoạt các enzyme (bản chất là protein)…kết quả là vi khuẩn sẽ chết.
- Hai phương pháp bằng nhiệt ướt trong phòng thí nghiệm: đun cách thủy, dùng nồi hấp (autoclave).

11/ Mô tả vắn tắt quá trình sử dụng autoclave ?
- Tháo van khóa vòi ra.
- Vặn nắp của nồi hấp ngược chiều kim đồng hồ và nâng lên.
- Đổ nước (khoảng 1 lít) vào đáy buồng.
- Đặt dụng cụ hoặc môi trường vào nồi.
- Kiểm tra bịt cao su sao cho đúng chỗ và ở điều kiện tốt.
- Đậy nắp lại, ấn xuống và xoay chặt theo chiều kim đồng hồ.
- Nhấn van khóa vòi xuống và cho chạy máy.
- Sau vài phút hơi nước sẽ được sinh ra và đạt đến áp suất 104 kPa ở nhiệt độ 121oC
- Cho hấp trong khoảng 15 phút.
- Tắt máy và kéo van khóa vòi ra cho toàn bộ hơi nóng thoát ra ngoài.
- Đảm bảo máy đo áp suất chỉ về số 0, nhiệt độ dưới 60oC.
- Mở nắp nồi, lấy môi trường và bảo quản ở nơi an toàn.
- Tháo hết nước ở đáy buồng.
- Cho van vào lại lỗ thoát, bắt đầu quá trình hấp khác.

12/ Khử trùng nhiệt ướt bằng đun sôi có loại bỏ hết vi khuẩn không, tại sao ?

- Cách khử khuẩn này chỉ hiệu quả đối với tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn vì đa số chúng không bền với nhiệt. Tuy nhiên nếu dùng để phá hủy nha bào thì phương pháp này tỏ ra không hiệu quả do ta chỉ nâng được nhiệt độ tối đa là 100oC còn nha bào của nhiều loài có tính kháng nhiệt rất cao, ví dụ: Clostridium thermosaccharolytium với nhiệt độ 132oC trong 4,4 phút mới chỉ giết được 90% bào tử.

13/ Phương pháp khử trùng bằng nhiệt khô diệt vi khuẩn như thế nào ?

- Phương pháp này sử dụng sức nóng làm đông protein và hủy hoại các thành phần cấu trúc của vi khuẩn.

14/ Định nghĩa thuật ngữ: môi trường phân biệt, môi trường phân lập, môi trường tăng sinh, môi trường dinh dưỡng, nuôi cấy thuần, nuôi cấy chuyền, nuôi cấy phân lập. Khuẩn lạc là gì, khử trùng môi trường là gì, nuôi cấy hiếu khí và kỵ khí bắt buộc, kỹ thuật khử khuẩn ?

- Môi trường phân biệt: là môi trường cho những phản ứng sinh hóa, có bổ sung thêm các chất ức chế, chỉ thị màu đặc biệt cho mỗi loại vi khuẩn giúp ta nhận biết trong môi trường chứa tạp khuẩn đó có những loài nào.

- Môi trường phân lập: là môi trường được cung cấp đầy đủ thành phần dinh dưỡng và các chất ức chế với mục đích chỉ cho một số dòng vi khuẩn phát triển.

- Môi trường tăng sinh: là môi trường đảm bảo dinh dưỡng thích hợp cho từng loài vi khuẩn nhằm mục đích tăng sinh khối tế bào.

- Môi trường dinh dưỡng: là môi trường có thể nuôi được nhiều loài vi khuẩn.

- Nuôi cấy thuần: là phương pháp nuôi cấy một dòng vi khuẩn thuần khiết được sinh ra qua nhiều thế hệ từ một tế bào ban đầu phân chia vô tính.

- Nuôi cấy chuyền: là dạng nuôi cấy chuyển vi sinh vật từ môi trường nghèo chất dinh dưỡng sang một môi trường giàu dinh dưỡng.

- Nuôi cấy phân lập: ria cấy vi khuẩn trên môi trường đặc để tạo nên khuẩn lạc thuần khiết có hoạt tính cao từ một tế bào ban đầu.

- Khuẩn lạc: là một đám tập hợp trên một môi trường đặc các vi khuẩn có tính chất giống nhau được sinh ra từ một tế bào ban đầu tạo thành một dòng thuần khiết.

- Khử trùng môi trường: là tạo một môi trường vô trùng để nuôi cấy các loài vi khuẩn cần thiết phục vụ cho những mục đích khác nhau.

- Nuôi cấy hiếu khí: là nuôi cấy các loài vi sinh vật ưa khí tuyệt đối.

- Nuôi cấy kỵ khí: là nuôi cấy các loài vi sinh vật yếm khí tuyệt đối.

- Kỹ thuật khử trùng: là kỹ thuật sử dụng các tác nhân vật lý, hóa học hoặc sinh học…để tiêu diệt tế bào vi sinh vật.

Nguồn : http://blog.360.yahoo.com/blog-Z0x93Fchc6dBHKgbyLuYpHhEVA--?cq=1&p=9